生物中翻译蛋白质中谁作为模板 实验对照设置

免疫共沉淀概述

相关服务：Co-IP蛋白相互作用检测服务

免疫共沉淀 (Co-IP) 是基于抗原和抗体之间的特异性相互作用研究蛋白质-蛋白质相互作用的经典方法。免疫共沉淀可用于检测两种已知蛋白质之间的相互作用，或使用已知蛋白质寻找与其相互作用的未知蛋白质。与其他分子间相互作用检测方法（GST pull down等）相比，免疫共沉淀实验的优点是蛋白质结合是在细胞内完成的，可以反映蛋白质在自然状态下的相互作用生物中翻译蛋白质中谁作为模板，结果更真实可靠。

实验原理

当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞中的许多蛋白质-蛋白质相互作用得以保留。如果细胞中存在XY蛋白复合物，用X（X也称为诱饵蛋白）抗体X进行免疫沉淀，则体内与X结合的蛋白Y（Y也称为靶蛋白）也沉淀出来。因此，将X的抗体加入细胞裂解液中以沉淀蛋白X，然后使用蛋白质印迹（WB）检测沉淀物中蛋白Y的存在。如果有，则说明细胞内存在XY蛋白复合物，即XY蛋白相互影响。

Co-IP实验过程

免疫沉淀实验流程为：采集蛋白样品-诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白-SDS-PAGE蛋白分离-WB检测目的蛋白的存在。详细的实验操作流程请到《免疫共沉淀实验操作流程及注意事项》查看。

收集蛋白质样本

蛋白质样品通常通过裂解细胞获得。Co-IP实验通常有两种，一种是内源性蛋白质相互作用验证，另一种是非内源性蛋白质相互作用验证。内源性相互作用是指细胞内两种蛋白质的相互作用，即通过质粒共转染将两种蛋白质转染到同一个细胞中进行表达。表达完成后，收集细胞并裂解获得蛋白质样品。非内源性相互作用 两种蛋白的相互作用发生在细胞外，即含有目的蛋白的动植物组织器官经过预处理和细胞裂解得到细胞裂解液，

沉淀诱饵蛋白

用磁珠偶联抗体沉淀诱饵蛋白：在样品中加入磁珠偶联抗体，抗体会与诱饵蛋白结合。用磁铁将磁珠拉下来，诱饵蛋白会一起沉淀。如果有目标蛋白与诱饵蛋白相互作用，也会沉淀。如果没有针对诱饵蛋白的特异性抗体，可以对诱饵蛋白（Myc、HA、Flag等）进行标记，然后使用标记抗体沉淀蛋白。

SDS-PAGE 和 WB 检测

得到沉淀后，需要验证沉淀中是否存在相互作用的蛋白质。先用SDS-PAGE分离蛋白复合物，然后用WB检测目标蛋白的存在（如果已知目标蛋白的分子量，可以直接用SDS-PAGE检测目标蛋白的存在） ）。

实验控制设置

为了保证*终的结果是自然状态下的交互，而不是某些方面造成的人为交互（即“误报”），在Co-IP的实验设计过程中，需要设置正确的控制。

假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+靶蛋白Y”，可能出现的“假阳性”和需要设置的相应实验对照如图所示下表：

可能的“误报”需要设置对照实验

磁珠和蛋白质 X 非特异性结合

“磁珠+抗体X+抗体Y”

磁珠与蛋白 Y 的非特异性结合

“磁珠+蛋白Y”

抗 X 抗体和 Y 非特异性结合

“磁珠+抗体X+蛋白Y”

抗 X 抗体（或磁珠）将与细胞裂解物中的其他蛋白质结合

“磁珠 + 抗体 X + 宿主细胞裂解物生物中翻译蛋白质中谁作为模板，无需质粒转染”

抗体的非特异性结合

“正常 IgG+蛋白 X+蛋白 Y”

上述为避免“假阳性”的对照称为阴性对照。除Co-IP实验外，还将设立阳性对照组（Input group）。Input 组直接使用抗体 X（抗体 Y）进行细胞裂解。执行 WB 测试以验证细胞裂解物中是否存在蛋白质 X（抗体 Y）。

在一些Co-IP实验中，实验者会对IP后的上清液进行蛋白X和蛋白Y的WB检测，这个对照组称为输出组。

内源性 Co-IP 实验用于验证两种蛋白质是否具有已知作用。如果*终结果是肯定的，则可以证明两种蛋白质之间存在相互作用；但如果结果是否定的，则不能证明这两种蛋白质具有已知作用。它们之间没有相互作用，也可能是细胞内蛋白质表达低引起的。因此，在进行内源性 Co-IP 验证两种蛋白质之间是否存在相互作用时，建议您先表达 Co-IP 作为对照。

免疫沉淀结果的真实性

为保证免疫沉淀实验中实验结果的真实性，应注意以下几点：

免疫共沉淀技术应用

免疫共沉淀实验可用于：

随着蛋白质研究的深入，人们将免疫沉淀法与其他方法结合起来，并在此基础上衍生出许多更为复杂的技术，使得分析方法更加多样化，其应用范围也相当广泛。免疫共沉淀是一种用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的技术，可应用于蛋白质复合物的研究。可以验证蛋白质复合物的存在，进而发现新的蛋白质复合物；免疫共沉淀技术结合免疫印迹或质谱等方法，用于确定诱饵蛋白与靶蛋白在自然状态下的结合，确定特定蛋白的新作用伙伴。免疫共沉淀实验也可应用于低丰度蛋白质的富集和浓缩。

同时，免疫沉淀技术是一种比较经典的探索蛋白质间相互作用的技术，在现代医学研究中具有广泛的应用和较高的可信度。蛋白质之间的相互作用渗透到体内每一个细胞的生命活动中。生物学中的许多现象，如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导、中间代谢等，都受到蛋白质相互作用的影响。交互调节。有些蛋白质由多个亚基组成，蛋白质之间的相互作用尤为常见。其他蛋白质结合得非常紧密；而其他人只有短暂的互动。然而，无论发生什么样的情况，它们都控制着大量的细胞生命活动，如细胞增殖、分化和死亡。并且通过蛋白质之间的相互作用，可以改变蛋白质在细胞内的动态特性，如底物结合特性、催化活性，也可以产生新的结合位点，从而改变蛋白质对蛋白质的特异性。基质。它可以灭活其他蛋白质并调节其他基因的表达。因此，只有让蛋白质之间的相互作用顺利进行，才能保证细胞的正常生命活动。由于蛋白质之间的相互作用具有如此重要的意义，对其检测方法的研究也备受关注和关注。从此，关于蛋白质之间关系的研究将越来越激烈。在将来，

其他交互检测方法